克隆化的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)一段時(shí)期培養(yǎng)之后，也還會(huì)因?yàn)榧?xì)胞突變或特定染色體的丟失，使部分細(xì)胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng)。克隆化次數(shù)的多少由分泌能力強(qiáng)弱和抗原的免疫性強(qiáng)弱而決定。一般說(shuō)，免疫性強(qiáng)的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定。

　　克隆化的方法很多，包括有軟瓊脂克隆化、顯微操作法、熒光激活分離法及限稀釋法等。

　　（一）軟瓊脂克隆化

　　借助撒在軟瓊脂上單個(gè)細(xì)胞定位生長(zhǎng)，而達(dá)到克隆化，具體操作如下：

　　1．配2.5％的瓊脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

　　2．將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合，置45℃水浴預(yù)熱。

　　3．將瓊脂糖與DMEM液混合，即為含0.5％瓊脂糖的*DMEM液，并加75×108 脾細(xì)胞。

　　4．每塊平皿加10ml，于室溫中凝固。

　　5．DMEM中的細(xì)胞與DMEM—瓊脂1:1混合，將細(xì)胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上，使其全部覆蓋。

　　6．放入CO2箱飽和濕度，37℃培養(yǎng)10天。

　　7．用PBS配制0.6％瓊脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保溫情況下取一試管，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球，0.2ml豚鼠補(bǔ)體，2.7ml 0.6％瓊脂糖。

　　8．用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍，可篩選抗羊紅血球Ig。

　　（二）顯微鏡操作法

　　在直徑6cm培養(yǎng)皿中，加入1ml 1.0×108細(xì)胞懸液放置5％CO2飽和濕度，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下，尋找那些與周圍相距甚遠(yuǎn)的單個(gè)細(xì)胞，將毛細(xì)管口（一頭有直角彎頭毛細(xì)管，一頭連接一尺長(zhǎng)乳膠管，用口控制液體進(jìn)入）水平置放于液面上，左右微動(dòng)，直到看見管口，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞，吸入毛細(xì)管，將管中細(xì)胞移到預(yù)先加有2.0×104~5.0×104飼養(yǎng)細(xì)胞96孔板內(nèi)，培養(yǎng)后，即可獲得單個(gè)細(xì)胞形成的克隆。

　　（三）熒光激活分離法

　　用一種熒光激活細(xì)胞分類器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，F(xiàn)ACS）。其基本原理是：將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細(xì)胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號(hào)由光電倍增管接收，再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號(hào)，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的信號(hào)對(duì)比，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同，將細(xì)胞分成不同級(jí)別，在電場(chǎng)中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。

　　（四）有限稀釋法

　　1．材料

　　（1）微量培養(yǎng)盤，盤內(nèi)各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細(xì)胞（即飼養(yǎng)細(xì)胞）每孔2萬(wàn)～4萬(wàn)。

　　（2）HT培養(yǎng)基

　　2．操作方法

　　（1）取出抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞，用HT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。并取樣進(jìn)行臺(tái)盼蘭染色，計(jì)數(shù)。

　　（2）用HT培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml和的懸液。

　　（3）用吸管將細(xì)胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤，每孔0.05ml，細(xì)胞含量分別為10個(gè)/孔、2個(gè)/孔、1個(gè)/孔和0.5個(gè)/孔。

　　（4）5％CO2飽和濕度，37℃培養(yǎng)。

　　（5）每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長(zhǎng)情況，選擇只有一個(gè)集落生長(zhǎng)的孔，棄掉兩個(gè)以上和沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)的孔。

　　（6）克隆大量繁殖后，布滿孔底的1/3～1/2時(shí)，測(cè)培養(yǎng)液抗體。

　　（7）抗體陽(yáng)性孔細(xì)胞，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細(xì)胞，建成克隆株。